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高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜聯用測定雞肉及雞肝中10種砷形態化合物
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高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜聯用測定雞肉及雞肝中10種砷形態化合物

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国际娱乐中心城平台 www.ujrri.icu 吳思霖,王欣美,于建,潘晨,王柯
(上海市食品藥品檢驗所)

摘要:建立了一種有效分離檢測雞肉及雞肝樣品中洛克沙砷(ROX)、阿散酸(ASA)、硝苯腫酸(NPAA)、卡巴腫(CBS)、砷酸(As V)、亞砷酸( As I1 )、一甲基腫酸(MMA)、二甲基腫酸(DMA)、砷甜菜堿(As B)和砷膽堿(As C)共10種砷形態化合物的高效液相色譜-電感耦合等離仔體質譜(HPLC-ICP-Ms)分析方法。采用10%甲醇為提取液,碳酸銨溶液為流動相,以陰離子分析柱將樣品提取液進行分離,最后進行 ICP-MS測定。10種砷形態化合物在0.1~100 pg/L范圍內線性關系良好,相關系數(r)均大于0.999,檢出限為0.3~1.5 Lg/kg,定量下限為1.0~5.0ug/kg,加標回收率為81.3%-97.7% ,相對標準偏差為0. 1% 3.5%。該法重現性好、靈敏度高,且采用組織研磨儀機械振蕩5 min即可成功提取10種砷形態化合物,與常規水浴加熱振蕩提取相比更加簡便、高效。該法適用于雞肉及雞肝樣品中10種砷形態化合物的同時檢測,雞肝樣品中檢出阿散酸和亞砷酸。

 

自1996年我國農業部批準有機腫制劑在動物飼料中使用后,阿散酸(ASA)、洛克沙砷(ROX)、卡巴腫(CBS)和硝苯腫酸(NPAA)等有機腫類制劑作為飼料添加劑已廣泛應用于畜禽養殖業。由于有機砷類制劑具有刺激動物生長的作用和較廣的抗菌譜,可改善禽畜肉質、提高飼料利用率,使動物呈現出 ,皮膚紅潤、皮毛光亮”的健康假象,進而造成禽畜養殖業有機腫類制劑被濫用亂用的現狀[1-5]。然而,有機腫制劑具有一定的毒性,會影響人體內酶的活性使其失活,導致細胞代謝紊亂,進而造成中樞神經系統失調,腦病的發病率升高[6-7],還可通過食物鏈危害人類健康[8]。因此開發一種可同時測定多種砷形態化合物的分析方法具有重要的現實意義。

目前國內外常采用高效液相色譜法( HPLC) [53、氣相色譜-質譜法(GC-MS )[9]、液相色譜-氫化物發生-原子熒光法(HPLC-AFS) [10-12]、高效液相色譜與電感耦合等離子體質譜( HPLC-ICP-MS)聯用16.13-13等分析砷形態化合物。HPLC-ICP-MS聯用技術因具有靈敏度高、檢出限低、線性范圍寬等優點,近年來已成為砷形態分析中最具應用前景的技術之一。

目前文獻中大多采用水浴加熱超聲或振蕩提取砷形態化合物,但方法耗時長(>2 h)且易導致有機腫的損失。本研究擬采用組織研磨儀機械振蕩提取,建立一種有效分離檢測ROX等10種砷形態化合物的HPLC-ICP-MS方法,以期為相關食品的監督檢驗提供方法參考。

 

1、實驗部分

1.1儀器與試劑

7700型電感耦合等離子體質譜儀、1100型高效液相色譜儀(美國Agilent公司); 1500型組織研磨儀(美國SPEX公司); T25 Digital ULTRA TURRAX型均質儀(德國IKA公司); 5810R型高速離心機(德國Eppendorf公司); Milli-Q Advantage A10超純水儀(美國Millipore公司)。

ROX等10種標準物質,純度均在98%以上(Dr. Ehrenstorfer或國家標準物質中心);甲醇(色譜純,德國Merck公司);正已烷(分析純,上海凌峰化學試劑有限公司)、碳酸銨(分析純,國藥集團)。

混合標準工作液:分別精密移取適量ROX, ASA, NPAA, CBS、砷酸(As V)、亞砷酸(As I1)-甲基腫酸( MMA)、二甲基腫酸(DMA)、砷甜菜堿(As B)和砷膽堿(As C),用水溶解稀釋配制成質量濃度為1.0 mg/L(以As計)的混合標準溶液。

樣品:雞肉和雞肝樣品購于上海各大農貿市場、家禽店。組織樣品勻漿后于-20 ℃冷凍保存 &Н。

1.2 高效液相色譜與電感耦合等離子體質譜條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱:陰離子分析柱Dionex lonPac AS 7 (250 mm ×4 mm)和陰離子?;ぶ鵇ionex lonPac AG7 (50 mm ×4 mm);柱溫:室溫;進樣量: 25uL;流速: 0.8 ml/min。流動相: A為3.85 mmol/L碳酸銨, B為300 mmol/L碳酸銨;梯度洗脫程序: 0.0~2.0 min, 100% A;2.1 ~5.5 min, 80% A: 5.6-8.6 min, 50% A: 8.7~18.0 min, 0% A: 18. 1 ~20.0 min, 100% A,流速均為0.8 ml/mino

1.2.2 質譜條件

高頻等離子體發射功率: 1550 W;載氣:氬氣(99.999% );載氣流量: 0.8 L/ min;載氣補償氣流量: 0.4 L/min;氦反應碰撞模式;氨氣流量: 4.0 ml/min;采樣錐/截取錐;P·錐;采樣深度: 8.0 mm;蠕動泵: 0.4r/min。采集質量數:砷75;積分時間: 0.5 s;采集時間: 1200 s。

1.3 樣液的制備

稱取約0.5g勻漿后的雞肉樣品(準確至0.001 g)于50 mL塑料離心管中,加入20 mlL 10%的甲醇溶液,于組織研磨儀(1 500次/min)中機械振蕩5 min,取出后于4 ℃ 12 000 r/min冷凍離心10 min,取10ml上清液置于離心管中,加入10 mL正己烷,振搖1 min后, 8000 r/min離心10 min,棄去上層正己烷。按此過程重復1次,吸取下層清液,經0.45 um有機濾膜過濾后待HPLC-ICP-MS檢測。按相同操作方法做空白試驗。

 

2結果與討論

2.1質譜條件的優化

使用Agilent調諧液(Li、 Y,Co,Ce和TI質量濃度為1 u/L)對儀器進行調諧,以保證儀器的最佳靈敏度和穩定性。砷的電離能較高,難以電離,采用高電離能1550 w以保證各種砷形態化合物能夠完全解離,同時優化載氣流量、補償氣流量、氨氣流量及采樣深度等,以提高儀器靈敏度,并使氧物和雙電荷的比率符合儀器推薦的要求,優化質譜條件見"1.2.2"所述。

2.2 色譜條件的優化

2.2.1 色譜柱的選擇

采用Agilent SB-Cis和 Hamilton PRP-X100色譜柱均無法同時分離10種砷形態化合物。最終采用Dionex lonPac AS7陰離子色譜柱,在堿性流動相系統下,使得砷以離子狀態存在,改善了色譜峰形,獲得了良好的分離效果(圖1)。

2.2.2 流動相的選擇

實驗發現磷酸鹽體系和甲醇-三氟乙酸體系均不能很好地分離10種砷形態化合物,而高濃度的碳酸銨溶液有利于ROX, NPAA, CBS, As V盡快洗脫。實驗最終確定以3.85 mmol/L碳酸銨溶液和300 mmol/L碳酸鏈溶液作為流動相,采用梯度洗脫的方式可在20 min內實現10種砷形態的良好分離,且峰形尖銳,分離度良好。

2.3 前處理條件的優化

2.3.1 取樣量的優化

分別考察了取樣量為0.5、1.0、2.0g時10種砷形態化合物的回收率。結果表明,取樣量僅對As I的提取有較大影響,取樣量越少, As 11的提取回收率越高。當取樣量為0.5g時, 10種砷形態化合物的提取率均大于80%,因此,確定本方法的取樣量為0.5 g。

2.3.2 提取溶劑的考察

分別考察了5%、10%、25%、50%的甲醇溶液對雞肉及雞肝樣品中10種砷形態化合物的提取效率。結果表明,當甲醇含量為50%時,高濃度的有機試劑易導致離子源不穩定,甚至熄滅,且有機物分解形成的碳易導致ICP-MS錐口堵塞,噪聲提高。當甲醇含量為10%和 25%時均可有效提取樣品中的有機腫,且含水比例高可顯著提高無機砷(As1和As V)的提取效率。當甲醇含量為5%時,無機砷的提取效率高,但有機腫(如ROX等)不能提取完全。因此,最終選用 10%的甲醇溶液作為提取溶劑,此時, 10種砷形態化合物的提取率均大于80%。

2.3.3 提取及凈化方式的考察

分別考察了均質提取、恒溫水浴振蕩提取以及微波輔助萃取3種提取方式對10種砷形態化合物的提取回收率,結果均不理想(表1)。而采用組織研磨儀高速振蕩5min可成功提取10種砷形態化合物,該法省時、簡便、高效,且不易造成樣品的污染和損失, 10種砷形態化合物的提取率均大于80%。采用甲醇溶液提取、正己烷萃取,可有效去除樣品基質中的蛋白質和油脂,所得溶液再經0.45 um有機濾膜過濾去除大顆粒雜質以起到多重凈化的作用。

2.4 方法線性范圍及檢出限

取10種砷的混合標準工作液(1.0 mg/L)用水稀釋成0.1、1、5、10,20,50,100 ug/L的混合標誰工作溶液,以質量濃度(x, ug/L)為橫坐標,各組分的響應值(y)為縱坐標,在優化條件下進行測定,繪制標準曲線。結果表明, 10種砷形態化合物在0.1-100 ug/L質量濃度范圍內線性良好,相關系數(2)均大于0.999,標準曲線回歸方程見表2,以HPLC-ICP-MS色譜峰信噪比(S/N)為3時所對應的濃度計算檢出限(LOD),以S/N為10時所對應的濃度計算定量下限(LOQ),在進樣量為25 uL時, 10種砷形態化合物的檢出限為0.3-1.5 ug/kg,定量下限為1.0-5.0 ug/kg(以Asi,表2)。

2.5 加標回收率及精密度

選用一系列空白樣品,分別添加10種砷的混合標準溶液,使添加水平為1、10,50ug/kg,其余按"1.3"方法操作,分析測定并計算其回收率和精密度,測得3個加標水平下的平均回收率為 81.3%~97.7% ,相對標準偏差(RSD, n=6)為0.1%~3.5%。

2.6 實際樣品的檢測

按照上述方法對雞肉和雞肝等30批次樣品進行測定,除1批雞肝樣品檢出ASA(3.4 ug/kg)和As "1(2. 7 ug/kg)外,其余樣品均呈陰性。表明方法可用于實際樣品的測定。

 

3 結論

本研究建立了HPLC-ICP-MS同時測定雞肉和雞肝中ROX, ASA、NPAA,CBS, As V、 As II MMA, DMA,As B和AsC共10種砷形態化合物的分析方法。樣品前處理簡單,回收率穩定,靈敏度高,適用于雞肉及雞肝樣品中10種砷形態化合物的定性定量分析,對排查和保證食品安全具有重要的現實意義。

 

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